왜 모든 변이를 Sanger로 확인할 수 없을까?

Exome·Genome 검사 후 가족검사에서 꼭 알아야 할 점

Exome이나 Genome 검사 결과를 받아본 뒤, 임상의나 보호자는 자연스럽게 가족검사를 떠올리게 됩니다.

• 이 변이가 부모에게서 유전된 것인지
• de novo인지
• 다른 가족 구성원에게도 존재하는지

그래서 많은 고객분들이 Exome·Genome 결과를 확인한 뒤, 쓰리빌리언의 Sanger sequencing 기반 가족검사 서비스인3B-VARIANT를 통해 가족검사를 의뢰하고자 합니다.

하지만 실제로 3B-VARIANT를 진행하려고 하면, 다음과 같은 상황을 마주하기도 합니다.

“해당 변이는 Sanger sequencing 기반 가족검사가 제한될 수 있습니다.”

결과지에 분명 변이가 보고되었는데, 왜 3B-VARIANT로 가족검사를 진행할 수 없을까요?

이 글에서는 3B-VARIANT를 사용하실 때 실제로 도움이 될 수 있도록, Sanger 기반 가족검사가 가능한 경우와 어려운 경우를 구분해 설명드리고자 합니다.

SNV는 되는데, CNV는 왜 어려울까?

SNV (단일염기변이)의 경우

SNV나 작은 indel은 변이 위치가 명확하고 염기 수준에서 정확히 정의되어 있기 때문에 대부분 Sanger sequencing으로 비교적 쉽게 확인할 수 있습니다. 그래서 가족검사 역시 Sanger 기반으로 문제없이 진행되는 경우가 많습니다.

CNV의 경우: 문제가 시작되는 지점

CNV는 이야기가 다릅니다. CNV는 다음과 같은 정보가 명확하지 않은 경우가 많습니다.

• 어느 엑손부터 어느 엑손까지 변이가 일어났는지
• 정확히 어디에서 끊어지고 이어졌는지 (breakpoint)

특히 Exome 기반 CNV 분석에서는 커버리지 변화로 CNV를 추정할 수는 있지만, 염기 단위의 정확한 breakpoint는 알 수 없는 경우가 대부분입니다.

👉 이 경우, Sanger sequencing으로는 타겟을 설계할 수 없기 때문에 confirmatory testing을 Sanger 기반으로 진행하기 어렵습니다.

Genome을 했는데도 안 되는 경우가 있다?

Genome sequencing은 Exome보다 넓은 영역을 커버하기 때문에 CNV나 구조 변이 분석에 유리한 경우가 많습니다. 하지만 그렇다고 해서 모든 경우에 breakpoint 확인이 가능한 것은 아닙니다.

NGS dead zone이란?

WGS는 모든 유전체 영역을 시퀀싱하지만, 모든 영역을 ‘분석’할 수 있는 것은 아닙니다. 분석이 어려운 영역은 문헌에서 ‘NGS dead zone’으로 표현되기도 합니다

NGS dead zone이 발생하는 이유는, 현재 널리 사용되는 short-read 시퀀싱 기술로는 다음과 같은 영역을 정확히 분석하는 데 한계가 있기 때문입니다:

• 반복서열이 많은 영역 (Repeat-rich region)
• Low Complexity Region (LCR): 구조적으로 복잡한 지역
• GC-rich region: GC 함량이 매우 높은 구간
• Mapping quality가 낮은 영역: Read가 정확히 어디에 속하는지 판단하기 어려운 구간

Recurrent CNV와 breakpoint의 문제

문제는, 이러한 LCR이 CNV 변이 발생률이 높은 구간이라는 점입니다.

특히 recurrent CNV(여러 환자에서 반복적으로 나타나는 CNV)의 경우, breakpoint가 이들 영역 내에 위치하는 경우가 많아, WGS를 수행하더라도 정확한 breakpoint 규명이 제한될 수 있습니다.

CNV 외에도 Sanger로 확인할 수 없는 변이들

CNV의 breakpoint 문제 외에도, Sanger sequencing으로는 확인이 불가능하거나 매우 어려운 변이 유형들이 있습니다.

1. Repeat expansion (반복서열 확장)

Huntington disease, Fragile X syndrome 등에서 나타나는 repeat expansion은 특정 서열이 수십~수백 번 반복되는 변이입니다.

• 일반적인 short read NGS나 Sanger로는 정확한 repeat 수를 측정하기 어렵습니다

2. Uniparental disomy (UPD)

UPD는 특정 염색체 또는 염색체 일부가 한쪽 부모로부터만 유래된 경우입니다.

• 염기서열 자체는 정상이므로 Sanger로는 검출 불가능합니다

3. Chromosome aneuploidy (염색체 수 이상)

Down syndrome (Trisomy 21), Turner syndrome (45,X) 등 염색체 개수의 이상입니다.

• Sanger sequencing은 염색체 수를 확인할 수 없습니다

4. Mobile element insertion (이동성 인자 삽입)

LINE, SINE, Alu element 등이 새로운 위치에 삽입되는 변이입니다.

• 삽입된 서열이 수백~수천 bp에 달할 수 있어 Sanger로 확인 어려울 수 있습니다

5. Sanger dead zone

Sanger sequencing 자체도 특정 영역에서는 정확도가 떨어집니다. 이러한 영역에 변이가 위치한 경우, Sanger로 시도는 해볼 수 있지만 결과의 신뢰도가 낮을 수 있습니다.

• GC-rich 또는 AT-rich region
• Homopolymer run (같은 염기가 연속되는 구간)
• Hairpin structure를 형성하는 서열

Sanger로 확인할 수 없는 변이의 경우, 다음과 같은 대안적 방법을 고려할 수 있습니다.

1. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

특정 유전자의 exon-level CNV를 확인하는 데 유용합니다. 하지만 MLPA는 미리 정해진 probe set을 사용하기 때문에, 해당 유전자에 대한 kit가 존재해야 한다는 제약이 있습니다.

2. qPCR (Quantitative PCR)

CNV의 존재 여부를 내부 구간을 타겟하여 정량적으로 확인할 수 있습니다. 비교적 빠르고 경제적입니다.

3. Array-CGH 또는 SNP array

전체 게놈 수준의 CNV를 확인할 수 있어 가족 구성원에서 같은 영역의 CNV 유무를 비교하는 데 유용합니다.

4. Targeted Genome Sequencing

특정 영역을 high coverage로 다시 시퀀싱하여 breakpoint를 정확히 규명하는 방법입니다. 비용과 시간이 더 소요되지만, 정확한 구조 파악이 가능합니다.

5. 기타 변이 유형의 경우

• Repeat expansion: Repeat-primed PCR, Southern blot, 또는 long-read sequencing
• UPD: SNP array, microsatellite marker 분석
• Chromosome aneuploidy: Karyotyping, FISH, QF-PCR
• Mobile element insertion: Long-read sequencing, specialized pipeline

정리하며

가족검사는 유전체 진단을 완성하는 필수 단계이지만, 모든 변이가 Sanger sequencing으로 확인 가능한 것은 아닙니다. 특히 CNV나 구조 변이의 경우, breakpoint 정보가 불명확하면 Sanger 기반 가족검사가 어려울 수 있습니다.

이런 경우에는 변이의 특성과 임상적 필요성을 고려하여 적절한 대안 검사법을 선택하는 것이 중요합니다.

검사 방법의 선택은 단순히 기술적 가능성뿐 아니라, 임상적 해석의 완성도와 가족 상담의 질에 직접적인 영향을 미치기 때문입니다.

📋 검사 레포트 예시로 보는 3B-VARIANT 가능 여부

의뢰 전 빠르게 확인해보세요!

유전체 검사 결과 레포트에서 변이 표기를 보고 3B-VARIANT(Sanger sequencing 기반 가족검사) 가능 여부를 바로 확인할 수 있습니다.

✅ Sanger 가족검사 (3B-VARIANT) 가능한 변이 표기

예시 1) Single Nucleotide Variant / Small indel

→ 정확한 변이 위치가 명시되어 있음 → Sanger 가능 ✅

예시 2) Breakpoint가 명확한 CNV 

→ Breakpoint 명확 → Sanger 가능 ✅

❌ Sanger 가족검사 (3B-VARIANT) 어려운 변이 표기

예시 1) Breakpoint 가 불명확한 CNV→ Breakpoint 불명확  (양 끝이 ‘?’ 로 표기) → Sanger 불가 ❌


예시 2) Repeat expansion

→ Sanger로 정확한 repeat number 확인 불가 ❌  

Repeat-primed PCR, Southern blot, 또는 long-read sequencing 권고